這篇文章研究了天然抗癌藥物候選物綠原酸的直接蛋白質(zhì)靶點(diǎn)和抗癌分子機(jī)制。

研究背景

1、綠原酸是一種天然產(chǎn)物，已被證明在許多臨床前模型中有效抑制腫瘤生長(zhǎng)，并在中國(guó)進(jìn)行了膠質(zhì)瘤患者的II期臨床試驗(yàn)。然而，CGA的直接蛋白質(zhì)靶點(diǎn)和抗癌分子機(jī)制仍然未知。

2、確定綠原酸的直接蛋白質(zhì)靶點(diǎn)具有挑戰(zhàn)性，因?yàn)樵S多天然產(chǎn)物通過(guò)非共價(jià)結(jié)合與其靶點(diǎn)相互作用，傳統(tǒng)的化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)方法難以捕捉這些相互作用。

3、活動(dòng)性基于探針的蛋白質(zhì)組學(xué)（ABPP）是一種結(jié)合了活動(dòng)性探針（ABP）和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的方法，用于識(shí)別生物活性天然產(chǎn)物的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)，以幫助闡明其作用模式和副作用。

研究方法

1、設(shè)計(jì)并合成了一種新型的雙功能光親和探針PAL-綠原酸，基于綠原酸的結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系（SAR），包含了光親和性和富集手柄。

2、使用親和性蛋白質(zhì)組學(xué)（AfBPP）化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)方法，通過(guò)多種檢測(cè)手段（如表面等離子共振（SPR）、等溫滴定量熱法（ITC）和冷凍電子顯微鏡（cryo-EM））對(duì)ACAT1/綠原酸相互作用進(jìn)行了深入研究。

3、具體步驟包括：使用Sephadex G-200尺寸排阻柱和HiTrap™ Q HP陰離子交換柱對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行純化和脫鹽，使用Thermo Fisher Titan Krios G3i電子顯微鏡進(jìn)行cryo-EM單顆粒分析，使用Biacore T200系統(tǒng)進(jìn)行SPR分析，以及使用EAQ-ITC儀器進(jìn)行ITC分析。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1、通過(guò)MTT法評(píng)估綠原酸對(duì)A375細(xì)胞的細(xì)胞毒性，細(xì)胞在96孔板中以1×10^4細(xì)胞/mL的密度接種，在5% CO2條件下孵育12小時(shí)，然后在缺氧條件下以1.25-10 mmol/L的綠原酸濃度處理72小時(shí)。

2、使用HisTrap HP柱進(jìn)行親和色譜純化ACAT1蛋白，并通過(guò)SDS-PAGE確認(rèn)其純度。

3、通過(guò)熱位移試驗(yàn)（TSA）和藥物親和響應(yīng)靶穩(wěn)定性（DARTS）試驗(yàn)評(píng)估綠原酸與ACAT1的結(jié)合穩(wěn)定性和親和力。

4、使用cryo-EM單顆粒分析研究ACAT1/綠原酸復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，數(shù)據(jù)在Thermo Fisher Titan Krios G3i電子顯微鏡上收集，使用MotionCor2進(jìn)行圖像對(duì)齊和求和，使用CTFFIND4.1進(jìn)行CTF估計(jì)，使用RELION3.1進(jìn)行粒子挑選和分類(lèi)。

結(jié)果與分析

1、綠原酸通過(guò)抑制ACAT1四聚體在Y407殘基上的磷酸化，從而抑制癌細(xì)胞增殖。

2、SPR分析顯示綠原酸與ACAT1的平衡解離常數(shù)（KD）約為2.58 mmol/L。

3、ITC數(shù)據(jù)顯示綠原酸與ACAT1的結(jié)合具有兩個(gè)位點(diǎn)，第一個(gè)位點(diǎn)的KD為9.68 mmol/L，第二個(gè)位點(diǎn)的KD為39.7 mmol/L。

4、cryo-EM結(jié)構(gòu)顯示綠原酸通過(guò)氫鍵網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定地結(jié)合在ACAT1的四聚體上，綠原酸的咖啡酸部分暴露在ACAT1結(jié)構(gòu)的外部，而奎寧酸部分位于變構(gòu)位點(diǎn)。

5、在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，綠原酸顯著抑制了ACAT1的活性，減少了Y407的磷酸化，增加了丙酮酸脫氫酶（PDH）的活性，從而抑制了腫瘤生長(zhǎng)。

總體結(jié)論

1、使用新型雙功能光親和探針PAL/綠原酸和AfBPP化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)方法，首次發(fā)現(xiàn)線粒體ACAT1是綠原酸的主要靶蛋白。

2、綠原酸通過(guò)非共價(jià)結(jié)合ACAT1四聚體，誘導(dǎo)廣泛的構(gòu)象變化，導(dǎo)致Y407磷酸化的消除，從而降低ACAT1活性。

3、這種新的作用模式解釋了綠原酸的臨床益處，并為未來(lái)的臨床應(yīng)用提供了新的見(jiàn)解。

這篇文章通過(guò)詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和多種生物化學(xué)技術(shù)，揭示了綠原酸作為ACAT1抑制劑的分子機(jī)制，為綠原酸在癌癥治療中的應(yīng)用提供了新的理論基礎(chǔ)。

文獻(xiàn)鏈接