引言

膠質(zhì)母細胞瘤（Glioblastoma，GBM），是腦腫瘤中最兇險、最難纏的一種，手術(shù)、放療、化療輪番上陣，也常常難以徹底清除。許多患者在短暫緩解后，腫瘤很快就會“卷土重來”，而且復(fù)發(fā)時的腫瘤似乎變得更加狡猾、更難對付。為什么GBM如此難以馴服？它在治療壓力下到底發(fā)生了什么變化？復(fù)發(fā)的腫瘤還是原來的“惡魔”嗎？

長期以來，研究人員就像試圖理解一個復(fù)雜城市的人口變遷，只能通過“批量”數(shù)據(jù)（bulk data），看到腫瘤作為一個整體的總貌。但這就像只知道城市總?cè)丝诤徒?jīng)濟總量，卻不知道里面有多少種職業(yè)、不同社區(qū)構(gòu)成如何變化，以及這些社區(qū)是如何相互影響的。GBM內(nèi)部是一個極其復(fù)雜的“生態(tài)系統(tǒng)”（ecosystem），不僅有瘋狂生長的惡性腫瘤細胞，還有各種各樣的“腫瘤微環(huán)境”（Tumor Microenvironment，TME）細胞，比如免疫細胞、血管細胞以及被腫瘤劫持的正常腦細胞。這些細胞的種類、比例、狀態(tài)，以及它們之間的互動，都在動態(tài)演變，共同決定了腫瘤的命運。

要真正揭開GBM復(fù)發(fā)的“變臉術(shù)”，我們需要一個更高清的視角，看到“城市”里的每一個“居民”及其變化。得益于單細胞組學(xué)技術(shù)（single-cell genomics），現(xiàn)在我們終于可以做到了。5月9日《Nature Genetics》的研究報道“Deciphering the longitudinal trajectories of glioblastoma ecosystems by integrative single-cell genomics”，匯集了全球頂尖力量，對近60名GBM患者在初發(fā)和復(fù)發(fā)時的腫瘤樣本進行了“單細胞”層面的深入分析。這不僅僅是對比兩個時間點，更是追蹤同一個腫瘤在治療前后的“縱向演變軌跡”（longitudinal trajectories）。他們在這趟“單細胞”的探索之旅中發(fā)現(xiàn)了哪些令人驚嘆、甚至有些出乎意料的秘密？GBM復(fù)發(fā)到底遵循著怎樣的“規(guī)則”？那些躲過治療的“種子”又是如何重塑腫瘤生態(tài)系統(tǒng)的？

進入“單細胞”時代：解碼腫瘤生態(tài)系統(tǒng)的秘密

近年來，單細胞組學(xué)（single-cell genomics）技術(shù)取得了突破，讓我們有機會以前所未有的分辨率去“窺探”腫瘤內(nèi)部的每一個細胞。這項技術(shù)能夠分別檢測腫瘤中每個細胞的基因表達（通過單核RNA測序single-nucleus RNA sequencing，snRNA-seq）或基因組變異（通過單細胞DNA測序）。

在這項新的研究中，研究人員正是利用了這種強大的工具，深入研究了GBM在接受標準治療前（初發(fā)，Primary，T1）和復(fù)發(fā)后（復(fù)發(fā)，Recurrence，T2/T3）的演變軌跡。他們建立了一個名為GBM CARE（Glioblastoma Cellular Analysis of Resistance and Evolution，膠質(zhì)母細胞瘤耐藥性和演變細胞分析）的大型研究聯(lián)盟，匯集了來自全球多家頂尖醫(yī)院的59名GBM患者的腫瘤樣本。對于這些患者，他們收集了初發(fā)和復(fù)發(fā)時的配對腫瘤樣本，總共分析了121個腫瘤樣本，并對其中約43萬個細胞的單核RNA進行了測序，同時對腫瘤組織進行了批量DNA測序（WES/WGS）。

這項研究的獨特之處在于其前所未有的規(guī)模（59對匹配樣本）和多組學(xué)整合分析（單細胞轉(zhuǎn)錄組 + 批量基因組），這使得研究人員能夠：1) 清晰地區(qū)分腫瘤中的惡性細胞和非惡性細胞；2) 詳細刻畫這些細胞在治療前后的“身份”（細胞類型Cell Type）和“狀態(tài)”（Malignant Cell State，即惡性細胞的不同轉(zhuǎn)錄組亞型）；3) 追蹤腫瘤生態(tài)系統(tǒng)的整體“構(gòu)成”（Composition）在治療前后的變化；4) 探索基因組變異對細胞狀態(tài)演變的影響；5) 最重要的一點，對比初發(fā)和復(fù)發(fā)樣本，揭示GBM生態(tài)系統(tǒng)的縱向演變軌跡。

復(fù)發(fā)腫瘤的“新面貌”：惡性細胞退潮，腦神經(jīng)細胞登場？

通過對這59對匹配的初發(fā)和復(fù)發(fā)GBM樣本進行詳細分析，研究人員發(fā)現(xiàn)了一些在腫瘤復(fù)發(fā)時普遍出現(xiàn)的“新面貌”。

其中最一致的變化發(fā)生在腫瘤生態(tài)系統(tǒng)的構(gòu)成層面：相比于初發(fā)腫瘤，復(fù)發(fā)腫瘤中的惡性細胞比例顯著降低。與此相對應(yīng)的是，腫瘤微環(huán)境中的一些非惡性細胞，尤其是屬于“膠質(zhì)-神經(jīng)”（glio-neural）類群的細胞，比例顯著增加。這些細胞主要包括少突膠質(zhì)細胞（Oligodendrocyte）、神經(jīng)元（Neuron）以及星形膠質(zhì)細胞（Astrocyte，ACs）。具體來說，研究發(fā)現(xiàn)，在66%的病例中觀察到了這種惡性細胞比例降低和膠質(zhì)-神經(jīng)TME細胞比例增加的趨勢。

為了驗證這一發(fā)現(xiàn)，研究人員還分析了一個獨立的、已發(fā)表的GBM單細胞數(shù)據(jù)集，結(jié)果也顯示出相似的趨勢：復(fù)發(fā)腫瘤中惡性細胞更少，而少突膠質(zhì)細胞比例更高。

更有意思的是，這項研究根據(jù)腫瘤復(fù)發(fā)時的細胞構(gòu)成（惡性細胞比例高低，以及低惡性細胞比例腫瘤中占主導(dǎo)的TME細胞類型）將患者分成了不同的組別。結(jié)果顯示，那些在復(fù)發(fā)時表現(xiàn)為“低惡性細胞比例且膠質(zhì)-神經(jīng)TME占主導(dǎo)”（LMF-GN）的患者，在接受第二次手術(shù)后，生存時間顯著長于其他組的患者（中位生存時間為19個月，而其他組為8個月，Log-rank檢驗 P = 0.012）。這提示我們，復(fù)發(fā)腫瘤的細胞構(gòu)成可能與患者的預(yù)后息息相關(guān)，膠質(zhì)-神經(jīng)TME的富集或許預(yù)示著一個相對“溫和”的復(fù)發(fā)類型。

惡性細胞的“百變狀態(tài)”：沒有統(tǒng)一的“劇本”

除了整體細胞構(gòu)成的變化，惡性腫瘤細胞本身也具有高度的轉(zhuǎn)錄組異質(zhì)性，表現(xiàn)為不同的“細胞狀態(tài)”（cell states）。這項研究根據(jù)基因表達模式，將惡性細胞劃分為了十種主要的狀態(tài)，包括細胞周期（Cell Cycle）、星形膠質(zhì)細胞樣（AC-like）、間充質(zhì)樣（MES-like）、應(yīng)激（Stress）、缺氧（Hypoxia）、神經(jīng)祖細胞樣（NPC-like）、少突膠質(zhì)細胞祖細胞樣（OPC-like）、分化神經(jīng)元樣（NEU-like）、膠質(zhì)祖細胞樣（GPC-like）以及纖毛相關(guān)狀態(tài)（Cilia-like）。此外，研究還定義了三種與細胞狀態(tài)比例無關(guān)的、反映腫瘤間異質(zhì)性的“基線基因表達譜”（Baseline Profiles，BP），分別注釋為膠質(zhì)BP（Glial-BP）、細胞外基質(zhì)BP（ECM-BP）和神經(jīng)元BP（Neuronal-BP）。

先前一些基于批量測序的研究曾提出，GBM復(fù)發(fā)時常常發(fā)生從“神經(jīng)祖細胞樣”（proneural）到“間充質(zhì)樣”（MES-like）的轉(zhuǎn)變。然而，這項大型單細胞研究卻揭示了一個更為復(fù)雜的景象：在整個隊列中，研究沒有觀察到任何一種特定的惡性細胞狀態(tài)在復(fù)發(fā)時普遍富集。也就是說，GBM惡性細胞在治療前后的“狀態(tài)轉(zhuǎn)變”并沒有一個統(tǒng)一的“劇本”。

但需要強調(diào)的是，雖然沒有統(tǒng)一的轉(zhuǎn)變趨勢，某些惡性細胞狀態(tài)的存在確實與預(yù)后相關(guān)。例如，研究發(fā)現(xiàn)在復(fù)發(fā)腫瘤中，如果間充質(zhì)樣/缺氧（MES-like/Hypoxia）狀態(tài)占主導(dǎo)，患者在第二次手術(shù)后的生存時間顯著更短（中位生存時間為5個月，而其他惡性細胞狀態(tài)占主導(dǎo)的患者為10.3個月，Log-rank檢驗 P = 0.00086）。這再次印證了腫瘤細胞狀態(tài)對患者預(yù)后的重要影響。

個體軌跡的“迷宮”：千變?nèi)f化的復(fù)發(fā)路徑

如果從單個患者的角度來看，GBM的復(fù)發(fā)軌跡則更加“捉摸不透”。盡管群體層面顯示了一些平均趨勢（如惡性細胞減少），但當研究人員對比每一對匹配的初發(fā)和復(fù)發(fā)樣本時，發(fā)現(xiàn)腫瘤的演變軌跡呈現(xiàn)出巨大的多樣性。

數(shù)據(jù)顯示，大多數(shù)樣本對在細胞構(gòu)成組別上發(fā)生了變化，高達68%的樣本對從初發(fā)時的某種構(gòu)成組別轉(zhuǎn)變?yōu)閺?fù)發(fā)時的另一種。同樣，64%的樣本對在主要的惡性細胞狀態(tài)組別上發(fā)生了轉(zhuǎn)變，56%在基線基因表達譜組別上發(fā)生了轉(zhuǎn)變。研究甚至觀察到了截然相反的演變軌跡，例如某個患者復(fù)發(fā)時AC-like細胞增加而GPC-like細胞減少，而另一個患者則恰好相反。

這種巨大的個體差異使得GBM的復(fù)發(fā)軌跡如同一個“迷宮”。盡管如此，這項研究發(fā)現(xiàn)，匹配的初發(fā)-復(fù)發(fā)樣本對之間的轉(zhuǎn)錄組相似度仍然顯著高于隨機配對的樣本。這意味著雖然路徑多樣，但同一患者的腫瘤在演變過程中保留了某種程度的“身份連續(xù)性”，它們之間的相似度仍然比隨機選取的兩個腫瘤更高。這提示我們，復(fù)發(fā)并非完全隨機，而是初發(fā)腫瘤固有特征與治療及微環(huán)境相互作用的結(jié)果。

撥開迷霧：誰在影響腫瘤的“變臉”？

既然復(fù)發(fā)軌跡如此多樣，那么是否存在一些特定的因素，會影響GBM的演變方向呢？研究人員將目光投向了兩種重要的“分子調(diào)節(jié)因子”（Molecular Modifiers）：MGMT基因的狀態(tài)和治療誘導(dǎo)的基因組變異。

首先是MGMT（O-6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶），它是一種DNA修復(fù)蛋白，其啟動子的甲基化狀態(tài)（MGMT promoter methylation status）與GBM對TMZ化療的敏感性密切相關(guān)。MGMT啟動子甲基化（MGMT-MET）的腫瘤通常對TMZ更敏感，患者預(yù)后也更好。這項研究發(fā)現(xiàn)，在MGMT啟動子甲基化的初發(fā)腫瘤中，惡性細胞本身的MGMT基因表達水平顯著低于非甲基化的腫瘤（P = 5.3 × 10??）。研究進一步構(gòu)建了一個模型，利用惡性細胞的MGMT表達水平來預(yù)測MGMT甲基化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)這種基于表達水平的預(yù)測與患者手術(shù)間隔時間（衡量治療反應(yīng)的一個指標）的相關(guān)性更強。

更重要的是，惡性細胞的MGMT表達水平與腫瘤復(fù)發(fā)時的間充質(zhì)樣（MES-like）狀態(tài)豐度顯著相關(guān)。具體來說，在MGMT表達水平較低的腫瘤（通常對應(yīng)MGMT-MET）中，復(fù)發(fā)時間充質(zhì)樣狀態(tài)的豐度會降低；而在MGMT表達水平較高的腫瘤（通常對應(yīng)MGMT-UM）中，復(fù)發(fā)時則表現(xiàn)出相反的模式，間充質(zhì)樣狀態(tài)的豐度升高。間充質(zhì)樣狀態(tài)通常與腫瘤的侵襲性、血管生成和耐藥性有關(guān)，因此MGMT-low腫瘤復(fù)發(fā)時MES-like狀態(tài)的減少，或許解釋了MGMT-MET患者更好的預(yù)后。

其次是治療誘導(dǎo)的基因組變異。研究發(fā)現(xiàn)，在復(fù)發(fā)腫瘤中，一些與DNA錯配修復(fù)缺陷相關(guān)的突變信號（如COSMICv3 SBS簽名中的SBS21）增加了，同時還有小片段插入/缺失（small insertion/deletion）的負擔(dān)增加。研究特別關(guān)注了小片段缺失，發(fā)現(xiàn)有10例復(fù)發(fā)腫瘤表現(xiàn)出明顯的small deletion phenotype。

有趣的是，那些獲得small deletion phenotype的復(fù)發(fā)腫瘤，與缺氧（Hypoxia）和間充質(zhì)樣（MES-like）細胞狀態(tài)的富集相關(guān)（paired Wilcoxon rank-sum test, P<0.05）。缺氧狀態(tài)已知與GBM對放療的耐藥性有關(guān)。這提示我們，治療誘導(dǎo)的基因組變異，尤其是小片段缺失，可能驅(qū)動腫瘤向更具侵襲性和耐藥性的細胞狀態(tài)演進。

總的來說，這項研究識別出兩個關(guān)鍵的“分子調(diào)節(jié)因子”：惡性細胞的MGMT表達水平（與TMZ反應(yīng)相關(guān)）和小片段缺失變異（可能與放療相關(guān)），它們能夠影響腫瘤復(fù)發(fā)時惡性細胞的狀態(tài)演變軌跡。

生態(tài)的共舞：腫瘤細胞與微環(huán)境的協(xié)同演進

這項研究還強調(diào)了一個重要的概念：GBM的“生態(tài)系統(tǒng)”是協(xié)同演進的。也就是說，惡性細胞的變化與腫瘤微環(huán)境的變化并非孤立發(fā)生，而是相互關(guān)聯(lián)、相互影響的。

研究發(fā)現(xiàn)，惡性細胞狀態(tài)豐度的變化與TME細胞構(gòu)成以及基線基因表達譜的變化之間存在顯著關(guān)聯(lián)。例如，惡性細胞的神經(jīng)元樣（NEU-like）狀態(tài)與神經(jīng)元基線表達譜密切相關(guān)，這種關(guān)聯(lián)在復(fù)發(fā)腫瘤中可能增強。同時，膠質(zhì)-神經(jīng)TME中的少突膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元表達的配體（如神經(jīng)粘連素NLGN和神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白NRG家族）被預(yù)測與惡性細胞的受體（如神經(jīng)粘連素家族NRXN或ERBB4）相互作用，這種相互作用在復(fù)發(fā)時可能更頻繁。這些發(fā)現(xiàn)支持了治療后殘余GBM細胞可能更深入地整合到腦實質(zhì)中的假說。

這意味著GBM的復(fù)發(fā)不僅是惡性細胞自身的演變，也是其與周圍微環(huán)境共同適應(yīng)和改變的過程。惡性細胞的狀態(tài)可能會影響它們與TME細胞的互動方式，而TME細胞的組成和分泌的信號也反過來影響惡性細胞的行為和狀態(tài)。這種復(fù)雜的“共舞”共同塑造了腫瘤的復(fù)發(fā)。

繪制復(fù)發(fā)“導(dǎo)航圖”：通往更精準的治療

這項大型單細胞研究為我們描繪了一幅前所未有的GBM復(fù)發(fā)“藍圖”。它清晰地展現(xiàn)了GBM復(fù)發(fā)軌跡的巨大多樣性和復(fù)雜性，挑戰(zhàn)了以往某些過于簡化的模型。雖然大多數(shù)軌跡是不可預(yù)測的“迷宮”，但研究成功地在這些“迷宮”中識別出了一些關(guān)鍵的“路標”和“岔路口”。

最普遍的變化是腫瘤生態(tài)系統(tǒng)的構(gòu)成轉(zhuǎn)變：惡性細胞比例下降，膠質(zhì)-神經(jīng)TME增加。這或許是一個積極的信號，并與更好的預(yù)后相關(guān)。同時，研究也揭示了惡性細胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變的復(fù)雜性，沒有統(tǒng)一的模式，但某些復(fù)發(fā)狀態(tài)（如間充質(zhì)樣/缺氧）預(yù)示著更差的預(yù)后。

更重要的是，研究識別出了影響這些軌跡的關(guān)鍵分子調(diào)節(jié)因子：惡性細胞的MGMT表達水平和治療誘導(dǎo)的小片段缺失。這些因素似乎能夠“引導(dǎo)”腫瘤走向特定的演變路徑（例如，MGMT-low與復(fù)發(fā)時MES-like狀態(tài)的減少相關(guān)，小片段缺失與缺氧/MES-like狀態(tài)的增加相關(guān)）。

這項研究的發(fā)現(xiàn)具有重要的臨床意義。它提示我們，GBM復(fù)發(fā)是一個高度個體化的過程。理解每個患者腫瘤獨特的演變軌跡以及驅(qū)動這一軌跡的關(guān)鍵因素，是實現(xiàn)精準治療的關(guān)鍵。未來，我們或許可以利用單細胞技術(shù)和基因組分析，為復(fù)發(fā)GBM患者繪制個性化的“復(fù)發(fā)導(dǎo)航圖”，根據(jù)腫瘤復(fù)發(fā)時的具體生態(tài)系統(tǒng)狀態(tài)和潛在的演變驅(qū)動力，選擇最有可能有效的治療策略。

盡管GBM的復(fù)發(fā)軌跡復(fù)雜如迷宮，但這項研究利用前沿的單細胞技術(shù)，為我們點亮了迷宮中的部分路徑，為最終征服這個頑固的“腦中惡魔”邁出了堅實的一步。未來的研究將需要進一步探索這些軌跡的詳細分子機制，并開發(fā)能夠針對特定復(fù)發(fā)亞型的創(chuàng)新療法。

參考文獻：

Spitzer A, et al. Deciphering the longitudinal trajectories of glioblastoma ecosystems by integrative single-cell genomics. Nat Genet. 2025 May;57(5):1168-1178.

來源于【生物探索】

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